長鏈非編碼RNA LOC103690121促進鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡

糖尿病引起的認知功能障礙是嚴重的糖尿病并發(fā)癥，目前其發(fā)病機制還不完全清楚，可能與大腦中的胰島素抵抗和葡萄糖誘導的神經(jīng)元凋亡有關。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是近十余年的生命科學研究中研究最火的領域之一，承擔了各種調(diào)控功能。已有報道LncRNA EBF3-AS表達與阿爾茨海默?。ˋD）患者的神經(jīng)細胞凋亡相關，而且最近lncRNA與糖尿病引起的認知功能障礙之間關系的研究正在增加。然而，lncRNA相關的糖尿病引起的認知障礙的機制仍然很不清楚，需要被發(fā)現(xiàn)。我們通過研究在海馬內(nèi)找出了一個與糖尿病大鼠認知功能障礙相關的差異表達的lncRNAs（LOC103690121），并對其作用機制進行了初步的探討。

我們首先用鏈脲佐菌素成功誘導了1型糖尿病大鼠模型，8周后水迷宮實驗證實糖尿病大鼠發(fā)生了認知功能減退。

圖1糖尿病大鼠的血糖水平，體重和認知功能A，實驗期間糖尿病和對照大鼠的空腹血糖水平；B，體重曲線；C，為兩組大鼠定位航行試驗中逃逸潛伏期的比較；D，為兩組大鼠空間探索試驗中目標象限逗留時間的比較。*，**和***分別與對照相比p <0.05，p <0.01和p <0.001。

HE和Nissl的染色顯示，與對照相比，糖尿病大鼠的海馬神經(jīng)元減少（圖2A和B）。TUNEL檢測顯示糖尿病大鼠TUNEL陽性（綠色）凋亡神經(jīng)元的百分比高于對照（圖2C）。Western印跡分析顯示糖尿病海馬中caspase-3/8/9和Bax的表達顯著高于對照組（p <0.001）;糖尿病大鼠中Bcl-2的表達低于對照（p <0.001，圖2D）。這些數(shù)據(jù)顯示糖尿病與大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增加有關。

圖2.海馬的組織病理學檢查A，HE染色的圖像（放大倍數(shù)×40）；B，尼氏染色結果（放大倍數(shù)×40）及統(tǒng)計學分析（計算放大倍數(shù)×400的每個視野的神經(jīng)元數(shù)）；C，TUNEL染色（放大倍數(shù)×200）結果的；D，Western blot分析海馬區(qū)凋亡相關蛋白。*，**和***分別與對照相比p <0.05，p <0.01和p <0.001。

為了研究糖尿病對lncRNA表達譜的影響，我們使用大鼠LncRNA芯片v2.0進行高通量分析，一共在SD大鼠海馬內(nèi)檢測到13,611個lncRNA和24,626個mRNA。與對照相比，糖尿病大鼠海馬中有49種上調(diào)的和52種下調(diào)的lncRNA。

圖3.差異LncRNA火山圖圖中每個點代表一個基因，紅色代表上調(diào)基因（fold change>1.5倍，P<0.05），綠色代表下調(diào)基因（fold change>1.5倍，P<0.05），黑色為無差異表達基因。

在這些lncRNA中，與對照相比，LOC103690121（ASRNV20033251探針，外顯子重疊，相關基因：ENSRNOT00000011775Unc79）在糖尿病中上調(diào)2.3倍（p <0.001，圖4A）。為了證實LOC103690121與糖尿病的關聯(lián)，我們檢測了用高濃度葡萄糖（35mmol / l）處理的大鼠海馬神經(jīng)元（RN-h細胞）中的LOC103690121，結果顯示葡萄糖處理以時間依賴性方式增加LOC103690121的相對表達水平（圖4B），在葡萄糖刺激后24小時具有最高相對水平。這一事實表明LOC103690121的相對表達與神經(jīng)元中的葡萄糖水平相關。

圖4.高葡萄糖對LOC103690121表達的影響A，葡萄糖處理后10個顯著表達lncRNAs的相對表達水平。B，LOC103690121葡萄糖處理后的表達模式

為了研究LOC103690121表達與糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元增殖的關聯(lián)，我們通過用針對LOC103690121的siRNA轉(zhuǎn)染RN-h神經(jīng)元細胞來抑制LOC103690121表達，并使用過表達質(zhì)粒增加LOC103690121表達（圖5A）。我們發(fā)現(xiàn)LOC103690121的過表達誘導較低的細胞活力（p <0.05，圖5B），較低的EdU陽性細胞百分比（p <0.001，圖5C和D），較高的凋亡神經(jīng)元百分比（p <0.001，圖5E）和葡萄糖處理相比，hoechst33342標記的細胞數(shù)量增加（圖5F）。相比之下，siRNA對LOC103690121表達的抑制逆轉(zhuǎn)了所有這些變化，顯示出更高的細胞活力（p <0.01），更高的EdU陽性細胞百分比（p <0.001），更低的凋亡神經(jīng)元百分比（p <0.001），以及與葡萄糖處理相比，hoechst33342標記的細胞數(shù)量減少（圖5）。

圖5.LOC103690121促進葡萄糖誘導的神經(jīng)元凋亡A，LOC103690121相對表達水平，C和D細胞存活率分析，EdU陽性細胞百分比，E，流式細胞儀檢測細胞凋亡，F(xiàn)，hoechst33342 / PI雙染（放大倍數(shù)×200）。**和***分別與對照相比p <0.01，p <0.001。###注意到與葡萄糖處理相比p <0.001。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示LOC103690121的過表達增強了葡萄糖誘導的凋亡相關蛋白的變化，包括促進caspase-3/8/9和Bax的表達并抑制Bcl-2表達（圖6A），而siRNA轉(zhuǎn)染阻礙了這些變化。這些數(shù)據(jù)表明，LOC103690121的表達對葡萄糖誘導的神經(jīng)細胞凋亡具有促進作用。為了探討與葡萄糖和LOC103690121誘導的神經(jīng)元凋亡相關的機制，我們檢測了PI3K / Akt信號在葡萄糖處理和lncRNA表達的響應中的表達。圖6B顯示通過葡萄糖處理和LOC103690121表達抑制p-PI3K和p-Akt表達的表達。LOC103690121過表達增強葡萄糖誘導的PI3K / Akt信號傳導失活。然而，siRNA對LOC103690121的抑制顯著恢復了葡萄糖誘導的變化（p <0.01，圖6B）。這些結果表明，LOC103690121表達抑制PI3K / Akt信號的激活，這可能促進葡萄糖誘導的神經(jīng)元凋亡。

圖6.Western印跡分析.A，凋亡相關蛋白的倍數(shù)變化，B，PI3K / Akt途徑蛋白的倍數(shù)變化。*和***分別與對照相比p <0.05和p <0.001。相對于葡萄糖處理，＃，##和###注意到p <0.05，p <0.01和p <0.001。

總之，我們的研究證實，STZ誘導的糖尿病和認知功能障礙與lncRNA表達譜譜的改變有關，包括上調(diào)的LOC103690121。高糖誘導LOC103690121表達，其表達與神經(jīng)元凋亡呈負相關。抑制LOC103690121逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導的神經(jīng)細胞凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)LOC103690121介導的神經(jīng)細胞凋亡與PI3K / Akt信號通路有關。

該研究成果發(fā)表在《Neuroscience Letters》上，題為“A long noncoding RNA LOC103690121 promotes hippocampus neuronalapoptosis in streptozotocin-induced type 1 diabetes”。