第二臨床醫(yī)學(xué)院郝敏課題組在《生物醫(yī)學(xué)與藥物治療》報(bào)道葉酸抑制人宮頸癌細(xì)胞miR-27a-3p表達(dá)及致癌活性的研究成果
近日，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院郝敏教授團(tuán)隊(duì)利用國(guó)家重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)課題“宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展的預(yù)警模式及治療策略優(yōu)化的多中心研究”宮頸癌篩查的大樣本人群數(shù)據(jù)在宮頸癌防治領(lǐng)域取得科研進(jìn)展。其研究揭示了宮頸癌細(xì)胞中mir-27a可能是該疾病的一個(gè)特異性生物標(biāo)志物和有前景的治療靶點(diǎn)。論文于2019年11月6日被Biomedicine & Pharmacotherapy雜志接收，題目為“Folate inhibits miR-27a-3p expression during cervical carcinoma progression and oncogenic activity in human cervical cancer cells”。
山西省處于內(nèi)陸地區(qū)，已知沿太行山脈走形的地域既是山西宮頸癌的高發(fā)區(qū)域，又是與葉酸缺乏相關(guān)的新生兒神經(jīng)管畸形高發(fā)區(qū)域，二者之間是否存在某些共同之處？課題組前期以人群現(xiàn)場(chǎng)（陽(yáng)曲地區(qū)）為基礎(chǔ)的大樣本、流行病學(xué)調(diào)查研究同樣顯示，血清葉酸水平低與CIN級(jí)別的增加密切相關(guān)，且與HR-HPV感染存在正相加交互作用[2]。近年研究顯示，葉酸缺乏參與調(diào)控miRNA異常表達(dá)與人體多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括神經(jīng)管畸形[6]、肝細(xì)胞癌[7]、人類(lèi)淋巴母細(xì)胞瘤[8]等。然而葉酸缺乏是否同樣可通過(guò)調(diào)控miRNA異常表達(dá)，在宮頸癌發(fā)生中發(fā)揮作用呢？目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。據(jù)此推測(cè)，葉酸缺乏可能是HR-HPV感染致宮頸癌發(fā)生的重要協(xié)同因素。葉酸參與DNA合成和DNA甲基化，導(dǎo)致腫瘤抑制基因（啟動(dòng)子區(qū)）高度甲基化，轉(zhuǎn)錄沉默，葉酸缺乏導(dǎo)致基因表達(dá)或不表達(dá)減少。miRNA表達(dá)異常是宮頸癌表觀遺傳機(jī)制的重要組成部分。
1.利用生物信息學(xué)分析miRNA芯片篩選的葉酸差異的宮頸癌組織miRNA表達(dá)譜并利用不同宮頸組織中miR-27a-3p的表達(dá)及其與血清葉酸的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證
本研究發(fā)現(xiàn)葉酸干預(yù)可影響鱗癌組織中miRNA的異常表達(dá)。通過(guò)go和kegg富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p通過(guò)miRNA靶網(wǎng)絡(luò)位于兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的核心。此外，利用string網(wǎng)站和cytoscape軟件識(shí)別的degs的ppi網(wǎng)絡(luò)建立miRNA通路網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)檢測(cè)不同葉酸濃度的SCC組織中miR-27a-3p表達(dá)與血清葉酸含量呈負(fù)相關(guān)，提示葉酸缺乏誘導(dǎo)的miR-27a-3p上調(diào)可能是宮頸癌的關(guān)鍵分子。
圖1.葉酸濃度差異影響宮頸癌組織中miRNA-27a-3p的表達(dá)
2. 葉酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均有抑制
選取不同濃度葉酸 (0、 200、 500、1000、2000nM)連續(xù)處理48h，檢測(cè)葉酸對(duì)于細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。作用48h后，低濃度葉酸作用于Hela和Siha細(xì)胞在增殖、遷移、侵襲細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)后，細(xì)胞數(shù)目較高濃度葉酸作用于宮頸癌細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)目明顯增加。實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)不同濃度葉酸誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高濃度葉酸明顯限制了細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。
圖2.葉酸濃度差異影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲
3.不同濃度的葉酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞中miR-27a-3p表達(dá)的影響，及miR-27a-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用
選取不同濃度葉酸連續(xù)處理48h，提取宮頸癌細(xì)胞的microRNA，利用熒光定量PCR測(cè)量miR-27a-3p的表達(dá)情況。提示高濃度葉酸作用于宮頸癌細(xì)胞在miR-27a-3p表達(dá)情況明顯低于低濃度葉酸作用于宮頸癌細(xì)胞miR-27a-3p的表達(dá)。
為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-27a-3p是否對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖侵襲有明顯的作用，運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)miR-27a-3p的表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)：提示宮頸癌細(xì)胞Hela經(jīng)過(guò)RNA轉(zhuǎn)染后inhibitor組48小時(shí)后數(shù)目較對(duì)照組明顯減少。細(xì)胞侵襲率顯著下降；mimics組48小時(shí)后數(shù)目較對(duì)照組明顯增加，細(xì)胞侵襲率顯著增加。
圖3.同葉酸密切相關(guān)的miR-27a-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用
本研究發(fā)現(xiàn)葉酸干預(yù)可影響腫瘤組織中miR-27a-3p的異常表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)表明葉酸能以劑量依賴(lài)的方式抑制Hela和Siha細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲，這與miR-27a-3p下調(diào)有關(guān)。這些結(jié)果提示miR-27a-3p可能是宮頸癌的一個(gè)特異性生物標(biāo)志物和有希望的治療靶點(diǎn)。
圖7.本課題的技術(shù)路線
山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院王哲博士為該論文的第一作者，郝敏教授為論文的通信作者。該項(xiàng)研究得到國(guó)家重大研發(fā)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金和山西省自然科學(xué)基金的資助。
合作團(tuán)隊(duì)聲明本文所述實(shí)驗(yàn)，均經(jīng)過(guò)山西省醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和通過(guò)，并嚴(yán)格按照批件所述的要求和流程實(shí)施。實(shí)驗(yàn)所涉及的數(shù)據(jù)遵循國(guó)家管理辦法進(jìn)行儲(chǔ)存和備案。
