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段金菊課題組研究銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的階段性成果

銅綠假單胞菌是臨床上重要的條件致病菌，其致病性強(qiáng)，致死率高。氟喹諾酮類藥物是臨床上治療銅綠假單胞菌感染的一類重要的藥物，其中環(huán)丙沙星和左氧氟沙星最常用。然而，銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性已經(jīng)出現(xiàn)。中國抗菌藥物監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示2017年銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)14.8%。此外，一項(xiàng)來自美國國家醫(yī)療健康網(wǎng)的報(bào)告表明銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到30%。銅綠假單胞菌的耐藥性正逐漸成為世界范圍內(nèi)的公共威脅。氟喹諾酮類藥物通過抑制細(xì)菌的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ來抑制DNA復(fù)制進(jìn)而起到殺菌作用。理論上講，銅綠假單胞菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的特定分子耐藥機(jī)制主要包括編碼DNA促旋酶的基因gyrA和gyrB的突變以及編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的基因parC和parE的突變。但目前的許多研究均表明gyrA和parC基因突變?cè)阢~綠假單胞菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，較少有研究闡明gyrB突變與耐藥性的關(guān)系。此外，臨床上在治療銅綠假單胞菌引起的感染過程中，患者最初對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感，但在使用一段時(shí)間后敏感性降低從而導(dǎo)致治療失敗。

2019年1月，段金菊課題組在SCI學(xué)術(shù)期刊Infection and Drug Resistance（醫(yī)學(xué)2區(qū)，影響因子3.443）發(fā)表了題目為“Mutations ingyrBplay an important role in ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa”的研究論文。該研究從上述問題出發(fā)，在體外用不同濃度的環(huán)丙沙星誘導(dǎo)銅綠假單胞菌5天，測(cè)定誘導(dǎo)后菌株的MIC值并分析其耐藥性。此外，測(cè)定外排泵基因的表達(dá)量和gyrA、gyrB、parC和parE四個(gè)基因的突變情況以探究該研究中銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制，并據(jù)此分析誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)耐藥性及耐藥基因突變的影響。

該研究的主要結(jié)果有：

1.體外環(huán)丙沙星和左氧氟沙星誘導(dǎo)后菌株的耐藥性

環(huán)丙沙星和左氧氟沙星誘導(dǎo)以后菌株的MIC值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)不一致（P<0.05），且與左氧氟沙星誘導(dǎo)相比，環(huán)丙沙星誘導(dǎo)后菌株的MIC值表現(xiàn)出更高和更快的增長（見圖1）。同時(shí)，環(huán)丙沙星誘導(dǎo)后菌株的耐藥率逐漸比左氧氟沙星誘導(dǎo)后菌株的耐藥率高，在誘導(dǎo)第5天，環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的菌株耐藥率明顯高于左氧氟沙星（P<0.05）。因此認(rèn)為體外環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于左氧氟沙星。之后均選用環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Figure 1 The comparison of MICs of strains to CIP and LEV between two groups.

A: ciprofloxacin (CIP) B: levofloxacin ( LEV)

*: There is statistical difference between CIP group and LEV group for the same MIC increment and the same drug (P<0.05).

**: There is statistical difference between CIP group and LEV group for the same MIC increment and the same drug (P<0.001).

2.外排泵基因的表達(dá)量

該研究中的細(xì)菌誘導(dǎo)以后外排泵未高表達(dá)，也就是說誘導(dǎo)以后細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制不是由于外排泵高表達(dá)。不同濃度（0.5×MIC，1×MIC，2×MIC和4×MIC）的環(huán)丙沙星誘導(dǎo)5天后，菌株外排泵的表達(dá)量結(jié)果見圖2。

Figure 2 The relative expression of two efflux pumps genes-MexA and MexE.

A: MexA B:MexE

The efflux pump was highly expressed if the relative expression of MexA was higher than 3.00.

The efflux pump was highly expressed if the relative expression of MexE was higher than 10.00.

3.喹諾酮類耐藥決定區(qū)基因的突變

在誘導(dǎo)以后的氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中，主要檢測(cè)到了gyrA和gyrB的突變，未檢測(cè)到parC和parE的有義突變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（見表1），gyrB在誘導(dǎo)第一天即發(fā)生突變，而gyrA在誘導(dǎo)第三天發(fā)生突變，也就是說gyrB比gyrA突變發(fā)生得早。而且，所有菌株都發(fā)生了gyrB突變，而僅5株菌發(fā)生了gyrA突變。同時(shí)，gyrB氨基酸突變的數(shù)目比gyrA的多。值得注意的是，有5株菌同時(shí)發(fā)生了gyrA和gyrB突變，但是其MIC值并不比僅發(fā)生gyrB突變的菌株MIC值高。因此，我們認(rèn)為gyrB突變?cè)阢~綠假單胞菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性中發(fā)揮重要作用。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長和濃度的增加，兩個(gè)基因發(fā)生氨基酸突變的數(shù)目均增加，結(jié)合菌株的MIC數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長和濃度的增加MIC值也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。這在一定程度上可以認(rèn)為抗菌藥物的使用濃度和時(shí)間影響菌株的耐藥水平和耐藥基因的突變情況，但兩者之間具體的關(guān)系需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

Table 1 Amino acid alterations of P.aeruginosa ingyrA

-: No amino acid alteration Blank: No sequencing

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院馮新媛碩士研究生為該論文第一作者，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部段金菊主任藥師為該論文的通信作者。該項(xiàng)目得到了山西省自然科學(xué)基金的支持。