在Neuroscience Letters發(fā)文揭示法舒地爾對髓鞘保護(hù)和再生的新機制
多發(fā)性硬化（MS）是一種自身免疫炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病。發(fā)病過程主要包括外周免疫細(xì)胞浸潤CNS，引發(fā)少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLs）死亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的髓鞘脫失和軸突變性。髓鞘再生被認(rèn)為是治療脫髓鞘疾病的關(guān)鍵因素，且髓鞘再生的增強與神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。大量研究表明，髓鞘再生可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元軸突的損傷，使臨床癥狀得到恢復(fù)。影響髓鞘再生的因素主要包括清除損傷區(qū)域的髓鞘碎片，產(chǎn)生促進(jìn)髓鞘再生的因子，以及加速少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs）向成熟的OLs轉(zhuǎn)化過程。髓鞘碎片在病變周圍聚集，不僅會引發(fā)炎癥反應(yīng)，還會抑制髓鞘在CNS中的形成。因此，在髓鞘形成過程中清除髓鞘碎片是十分必要的。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在髓鞘再生過程中扮演著重要角色。小膠質(zhì)細(xì)胞不僅吞噬髓鞘碎片，減輕炎癥反應(yīng)，還可在清除髓鞘碎片的過程中產(chǎn)生再生因子，加速髓鞘再生。Cuprizone（CPZ）模型作為研究髓鞘再生的動物模型，病理表現(xiàn)出廣泛的髓鞘碎片聚集和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。目前，雖然一些免疫調(diào)節(jié)藥物已被證明對MS有效，但仍缺乏促進(jìn)髓鞘再生的有效性證據(jù)。法舒地爾作為一種典型的Rho激酶抑制劑，在脫髓鞘疾病中表現(xiàn)出多種優(yōu)勢。一系列研究表明，法舒地爾可能通過抑制神經(jīng)炎癥、激活神經(jīng)干細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，進(jìn)而發(fā)揮CNS保護(hù)功能。先前課題組研究表明，法舒地爾通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化發(fā)揮髓鞘保護(hù)的作用。因此，法舒地爾促進(jìn)MS的髓鞘再生機制需要進(jìn)一步闡明。
2021年4月7日，山西醫(yī)科大學(xué)附屬白求恩醫(yī)院李新毅和馬存根課題組在Neuroscience Letters上發(fā)表了題為“Fasudil enhances the phagocytosis of myelin debris and the expression of neurotrophic factors in cuprizone-induced demyelinating mice.”的研究論文。該研究從上述問題出發(fā)，在體內(nèi)外觀察法舒地爾對小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的影響。此外，進(jìn)一步觀察吞噬髓鞘碎片的小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌及對髓鞘再生的影響。
該研究的主要結(jié)果有：
1.法舒地爾體外促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片
課題組首先篩選了法舒地爾誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬熒光髓鞘碎片（FMD）的最佳濃度和時間，發(fā)現(xiàn)15 μg/ml法舒地爾作用48 h可增強小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片的吞噬作用，表明法舒地爾的作用濃度和吞噬時間適合后續(xù)研究。通過體外實驗，課題組發(fā)現(xiàn)法舒地爾能夠上調(diào)TREM2/DAP12通路mRNA和蛋白的表達(dá)（圖1）。
2. 法舒地爾體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，法舒地爾能夠增強吞噬碎片的小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)BDNF和GDNF，提示體外小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片可能上調(diào)BDNF和GDNF的表達(dá)（圖2）。進(jìn)一步收集PBS（M0）、法舒地爾（M1）、FMD/PBS（M2）或FMD/法舒地爾（M3）干預(yù)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液（CMs），孵育OPCs 9天，發(fā)現(xiàn)FMD/法舒地爾組CMs干預(yù)后OPCs的MBP染色明顯增強，多極分支明顯（圖3）。
綜上所述，法舒地爾促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞攝取FMD，刺激BDNF和GDNF的表達(dá)，促進(jìn)OPCs體外成熟。
3. 法舒地爾在體內(nèi)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片
通過腦立體定位注射FMD證實了法舒地爾可促進(jìn)CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘模型吞噬清除外源性髓鞘碎片（圖4）。進(jìn)一步通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘存在共定位關(guān)系，提示髓鞘的破壞導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的富集和髓鞘碎片的吞噬（圖5）。
4. 法舒地爾誘導(dǎo)體內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，再生髓鞘
通過免疫熒光染色和western blot分析發(fā)現(xiàn)，法舒地爾能夠明顯上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF和GDNF的表達(dá)，這與我們體外實驗結(jié)果相一致（圖6）。同時發(fā)現(xiàn)，法舒地爾干預(yù)可增加OPCs標(biāo)志物（Oligo2，PDGFRα）和OLs標(biāo)志物（MBP）的表達(dá)，提示法舒地爾促進(jìn)CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠OPCs的形成和成熟。
山西醫(yī)科大學(xué)附屬白求恩醫(yī)院博士生丁智斌為該論文第一作者，李新毅、馬存根和肖保國為該論文的共同通信作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目、山西省國際科技合作項目、山西省留學(xué)基金委科研項目等多方資助。
圖1 法舒地爾誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬髓鞘碎片
圖2 法舒地爾上調(diào)FMD吞噬的BV-2細(xì)胞BDNF和GDNF的表達(dá)
圖3 髓鞘碎片/法舒地爾組BV-2細(xì)胞CMs促進(jìn)OPCs成熟
圖4 法舒地爾促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞清除CPZ小鼠腦內(nèi)外源性髓鞘碎片
圖5 法舒地爾誘導(dǎo)CPZ小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)BDNF和GDNF
圖6 法舒地爾可促進(jìn)OPCs的體內(nèi)再生和分化
