實驗動物中心王春芳課題組發(fā)現調控神經發(fā)育的關鍵microRNA分子
2021年6月11日，實驗動物中心王春芳課題組在Experimental Biology and Medicine發(fā)表體味“miR-31 promotes neural stem cell proliferation and restores motor function after spinal cord injury injury”的研究論文，發(fā)現了在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，敲降miR-31的表達后，斑馬魚的側索神經元不發(fā)育，并伴有大量的凋亡顆粒，喪失運動功能。
脊髓損傷后的神經再生及突觸連接一直是治療脊髓損傷的難點?，F有研究證實在脊髓損傷后局部注射神經干細胞可以有效恢復損傷后的運動和感覺功能1。但神經干細胞的獲得和使用收到倫理學的限制。而在課題組前期的研究中發(fā)現，miR-31在神經干細胞高表達在運動神經元低表達2。對miR-31進行生物信息學分析的研究也顯示，miR-31在物種間高度保守，由此推測miR-31可能在NSCs的分化過程中起著重要重要作用。同時，Liu等也發(fā)現，在SCI后，miR-31表達增高3，說明miR-31在SCI的修復過程中起著一定作用。Xu的實驗說明脊髓結扎后的3天、7天和13天血清中miR-31的表達升高4，HL Chang證實在SNL、DRT和VRT損傷7天后DGR神經元的miR-31的表達上調5。但miR-31具體的治療機制及在神經發(fā)育中的具體作用未知。
為了研究miR-31調控神經發(fā)育的具體作用和相關機制，王春芳課題組先通過生物信息學分析，預測miR-31是否會對神經發(fā)育產生作用。證實后，在HB9:EGFP轉基因斑馬魚的基礎上，構建了斑馬魚的miR-31敲降模型。結果發(fā)現miR-31敲降后斑馬魚的脊索及側索發(fā)育異常，MNs數量減少，斑馬魚喪失運動功能。同時，AO染色顯示在miR-31 MO斑馬魚的中樞神經部位和尾部出現大量凋亡細胞，但在側索部位未出現凋亡顆粒。
圖1-1 Morpholino敲降miR-31表達后導致斑馬魚MNs發(fā)育異常。
斑馬魚胚胎注射了8ng miR-31 MO或8ng Standard Control后MNs的生長發(fā)育狀況（A-H）。熒光顯微鏡下可以觀察到48 hpf時的斑馬魚軀干部位的MNs（白色箭頭）的及其結構，在Standard Control組可以發(fā)現脊索和側索正常發(fā)育（B-D）。而在miR-31 MO組，發(fā)現脊索熒光強度較Standard Control組低，側索無法觀察到，神經系統(tǒng)發(fā)育異常（F-H）。同時逃逸反應顯示48 hpf的miR-31 MO組斑馬魚無反應。
圖2軟件分析對比miR-31MO組和Standard Control組斑馬魚脊髓部位出現凋亡顆粒的情況。
為了驗證MNs缺失是否由凋亡引起，我們使用AO評估斑馬魚在26 hpf時的細胞凋亡情況。對照組與miR-31 MO組比較發(fā)現，對照組中僅有少量凋亡顆粒，而miR-31 MO組則有大量凋亡顆粒沿中樞神經系統(tǒng)脊索呈線性分布。此外，側區(qū)凋亡顆粒相對較脊索部小。Image J定量分析了miR-31 MO與對照組的凋亡顆粒數量，發(fā)現miR-31 MO的平均凋亡顆粒數量為125.9個，而對照組為5個，差異為25倍。這些結果表明，miR-31敲降后，斑馬魚的脊髓部位在神經元缺失的情況下，同時出現大量細胞凋亡，側索未形成，斑馬魚失去運動功能。
NSCs對神經系統(tǒng)的注射治療正越來越受到人們的關注，但是如何獲取NSCs是困擾人們的難題。綜合以上實驗，我們推測miR-31可以促進內源性NSCs的存活和增殖。對于需要注射NSCs進行治療的SCI患者或其他中樞神經受損的病人，可以在體外合成miR-31 agomir，注射至體內，促進內源性NSCs的增殖和分化，用于治療神經損傷類疾病，避免諸多麻煩。
1. Piltti KM, Funes GM, Avakian SN, et al. Increasing Human Neural Stem Cell Transplantation Dose Alters Oligodendroglial and Neuronal Differentiation after Spinal Cord Injury. Stem Cell Reports 2017;8:1534-48.
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