敲除Sp7+成骨細(xì)胞中的印度刺猬因子通過抑制成骨分化及骨形成，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)以嚴(yán)重骨骼發(fā)育不良為特征的侏儒表型
哺乳動(dòng)物骨骼系統(tǒng)由骨組織與軟骨組織組成，主要起源于三種不同胚層的細(xì)胞，通過兩種骨化方式發(fā)育而成：即膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。在骨發(fā)育過程中，成骨細(xì)胞的增殖及分化過程受多種激素、生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)控，其中重要的信號(hào)通路有BMP/Smads、Wnt/β-catenin、Fibroblast growth factor (FGF)、Hedgehog，關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子包括Runx2及Sp7等。
Hedgehog (Hh)信號(hào)通路在脊椎動(dòng)物和昆蟲的多種發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，是物種間高度保守的信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物中存在三種刺猬基因：音速刺猬因子 (Shh)、印度刺猬因子 (Ihh)和沙漠刺猬因子 (Dhh)；而骨發(fā)育過程中，印度刺猬蛋白(Ihh)作為Hedgehog信號(hào)通路配體生物作用的主要輸入，印度刺猬因子（Indian hedgehog，Ihh）是調(diào)控復(fù)雜的軟骨內(nèi)成骨的重要細(xì)胞因子，主要表達(dá)于前肥大軟骨細(xì)胞、部分肥大軟骨細(xì)胞及成骨譜系細(xì)胞；目前研究已闡明人類IHH基因的突變是A1型短指畸形(brachydactyly type A1)和肢端股骨頭發(fā)育不良(acrocapitofemoral dysplasia)等遺傳性疾病的關(guān)鍵致病因素。小鼠遺傳學(xué)研究進(jìn)一步表明軟骨細(xì)胞來源的印度刺猬因子通過調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖、肥大分化，參與成軟骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的定向，從而維持生長板的正常發(fā)育及軟骨內(nèi)成骨。而成骨譜系細(xì)胞的印度刺猬因子調(diào)控成骨細(xì)胞分化及骨形成作用的相關(guān)研究很少，其可能的分子機(jī)制仍有待闡明。
鋅指轉(zhuǎn)錄因子Sp7，也稱Osterix，是一種包含C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的分化過程中起到至關(guān)重要的作用。通過Sp7基因表達(dá)介導(dǎo)Cre 的表達(dá)，主要靶向軟骨膜、骨膜及初級(jí)骨化中心的成骨譜系細(xì)胞并特異性敲除打靶的目的基因。本課題組通過Sp7-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠（該小鼠正常發(fā)育，與野生型小鼠無異），Ihhfl/fl基因打靶小鼠交配，培育基因型為Sp7-iCre;Ihhfl/fl的基因工程小鼠，體內(nèi)特異性敲除Sp7+成骨細(xì)胞中的Ihh基因，在體研究成骨細(xì)胞中的Ihh基因調(diào)控骨形成的作用并初步探究其潛在的分子機(jī)制。
我們的研究結(jié)果表明揭示了Sp7+成骨細(xì)胞的Ihh基因調(diào)控細(xì)胞分化及骨形成的重要作用。該Ihh基因特異性敲除小鼠以短肢、矮小畸形為特征，表現(xiàn)為全身骨發(fā)育不良，尤其皮質(zhì)骨和小梁骨形成障礙，生長板的異常形態(tài)，但并不影響趾（指）間關(guān)節(jié)分割正常；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明Sp7+成骨細(xì)胞中的Ihh基因可能通過BMP2/SMAD/RUNX2信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化、礦化及骨形成。
圖1 Sp7-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的基因靶向策略；Sp7-iCre；Ihhfl/fl和Ihhfl/fl小鼠的育種策略。
圖2 敲除成骨細(xì)胞Ihh基因?qū)е滦∈髧?yán)重的發(fā)育不良、骨骼異常和出生時(shí)的死亡。測量新生小鼠的體重減輕和體長減小。p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖3 兩組小鼠（P0）脛骨石蠟切片的H&E染色，bar=100μm（上圖），20μm（中圖），50μm（下圖），分別；Von Kossa染色（陽性位點(diǎn)著黑色）和Masson's Trichrome染色（新生骨著藍(lán)色）；兩組小鼠的組織形態(tài)學(xué)定量結(jié)果，n = 4。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
此該文已于2022年6月3日被《Calcified Tissue International (CTIN)》接收。山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2019級(jí)博士研究生王云飛為文章第一作者，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院李鵬翠教授為通訊作者。
