楊曉峰、魏亮研究組和合作者構(gòu)建并驗(yàn)證了膀胱癌體細(xì)胞突變驅(qū)動(dòng)的代謝相關(guān)基因預(yù)后模型
膀胱癌(BLCA)是泌尿系統(tǒng)中侵襲性最高的惡性腫瘤之一，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，盡管方法多樣且均取得巨大進(jìn)步，但仍有超過(guò)半數(shù)的患者治療后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或進(jìn)展，如何按照預(yù)后準(zhǔn)確進(jìn)行患者分群，并提早調(diào)整治療策略，是臨床函待解決的難題。改變現(xiàn)狀的方法之一應(yīng)是研究和納入更多新的有價(jià)值的預(yù)后因子，來(lái)優(yōu)化我們的預(yù)后預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)體系，尤其是篩選出高危病人并提早調(diào)整治療方案，同時(shí)也有望找到新的治療靶點(diǎn)。因此，研究新型分子生物標(biāo)記物在膀胱癌的篩查、診治、預(yù)后中有著巨大的潛力和價(jià)值。
近些年研究表明癌細(xì)胞普遍存在代謝改變，以維持其在不利環(huán)境下的增殖和演進(jìn)，主要表現(xiàn)為：葡萄糖代謝以有氧糖酵解為主，氧化磷酸化減弱，磷酸戊糖代謝途徑增強(qiáng)，谷氨酰胺分解代謝活躍，脂肪酸從頭合成及β-氧化反應(yīng)活躍等，這些代謝改變被稱為代謝重編程( Metabolic reprogramming )。限制或改變上述代謝重編程過(guò)程可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)代謝重編程可作為腫瘤靶向治療的新策略。而基因改變往往會(huì)通過(guò)重編程代謝導(dǎo)致癌癥進(jìn)展，它是表觀遺傳、氧化還原狀態(tài)、外泌體、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和免疫細(xì)胞改變的重要原因，這也使得癌癥代謝及其相關(guān)基因成為研究的熱點(diǎn)。
2023年5月楊曉峰、魏亮研究組和合作者撰寫的論文Construction and validation of a prognostic model of metabolism-related genes driven by somatic mutation in bladder cancer被Frontiers in Bioscience-Landmark雜志錄用。本研究通過(guò)綜合生物信息學(xué)分析，初步建立并驗(yàn)證了一個(gè)新的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，揭示了體細(xì)胞突變驅(qū)動(dòng)的代謝相關(guān)基因在膀胱癌中的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值和功能，并預(yù)測(cè)了膀胱癌免疫治療、化療療效的潛在標(biāo)記物。另外，通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析我們發(fā)掘了生物標(biāo)志物隨上皮細(xì)胞狀態(tài)的變化發(fā)生表達(dá)量的改變，并據(jù)此鑒定出影響膀胱癌預(yù)后和需要我們深入研究的兩個(gè)關(guān)鍵上皮細(xì)胞亞群。
1.差異表達(dá)的代謝相關(guān)基因的篩選和功能富集分析
本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到201個(gè)差異表達(dá)代謝相關(guān)基因（DEMRGs），其中93個(gè)代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，108個(gè)代謝相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。功能富集分析得到477個(gè)GO BP，47個(gè)GO CC，178個(gè)GO MF，包括酒精代謝過(guò)程、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過(guò)程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物、轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、離子通道活性等。富集到226條KEGG通路，包括cGMP-PKG信號(hào)通路、嘌呤代謝、胰腺分泌、花生四烯酸代謝、色氨酸代謝等。（圖1）
圖1 DEMRGs的篩選和功能富集分析
2.風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建
根據(jù)TCGA體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，篩選出24個(gè)突變頻率>為3%的DEMRGs。采用單因素和多因素COX分析，鑒定出5個(gè)膀胱的預(yù)后生物標(biāo)志物（FASN、ATP8B2、ABCC4、ATP2B4、MTHFD1L）。然后我們繪制5個(gè)預(yù)后相關(guān)基因的ROC曲線，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ突虻念A(yù)后預(yù)測(cè)能力，結(jié)果顯示單個(gè)基因的AUC均大于0.7，但利用這5個(gè)基因構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型，ROC曲線的AUC為0.97，證實(shí)了模型的有效性和準(zhǔn)確性更高，優(yōu)于單個(gè)基因的預(yù)測(cè)能力。（圖2）
圖2 膀胱癌中的模型基因的分析
3.預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的驗(yàn)證
繪制了兩組模型基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)曲線和熱圖。ABCC4在低危組的表達(dá)量較高，且HR <為1，提示它可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的一個(gè)重要因素。而FASN、ATP8B2、ATP2B4、MTHFD1L為HR > 1，在高危組中高表達(dá)。Kaplan-Meier曲線顯示，高危組患者的生存率低于低危組。ROC曲線顯示1-5年的auc均為>0.6。隨后，在測(cè)試集和驗(yàn)證集中評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后。在測(cè)試集、驗(yàn)證集和訓(xùn)練集中，基因表達(dá)模式是一致的。另外，計(jì)算不同組的突變頻率，所有突變樣本中生物標(biāo)志物的突變頻率均大于8%，高危組的突變類型增加。
圖3 預(yù)后基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)的驗(yàn)證
4.風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立性預(yù)測(cè)
相關(guān)性結(jié)果顯示，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床特征之間存在顯著性差異。T期K-M生存曲線結(jié)果顯示，兩組在病理T2、T3、T4期生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除性別外，所有臨床因素的p值均小于0.05。采用多變量Cox分析，將riskScore、t病理、年齡和n病理作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)，列線圖和校準(zhǔn)曲線所示，列線圖C指數(shù)為0.7287，說(shuō)明該模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。（圖4）
圖4 膀胱癌患者5個(gè)預(yù)后基因的臨床價(jià)值評(píng)估
5.免疫微環(huán)境、免疫檢查點(diǎn)及抗癌藥物敏感性分析
我們分析了這些相關(guān)性，以證明免疫微環(huán)境中細(xì)胞浸潤(rùn)的相互作用。對(duì)22個(gè)免疫細(xì)胞群的分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)免疫細(xì)胞的比例有顯著差異。這4種免疫細(xì)胞分別是B細(xì)胞記憶細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、靜止的樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞。K-M生存曲線分析顯示，兩組LGALS9、PDCD1和TIGHT的免疫檢查點(diǎn)有顯著差異。并對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組間三個(gè)免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平存在顯著差異，低危組LGALS9顯著升高，PDCD1缺失，TIGHT明顯降低。相關(guān)分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與PDCD1、TIGIF呈顯著正相關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與LGALS9呈負(fù)相關(guān)。（圖5）
另外，在198種抗癌藥物反應(yīng)中，有146種藥物在兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間存在顯著差異。高危組患者對(duì)42種藥物更為敏感，包括5-Fluorouracil_1073、Camptothecin_1003、Docetaxel_1819等。而低危組患者對(duì)104種藥物更為敏感，包括Cisplatin_1005、Epirubicin_1511、Gemcitabine_1190、Vinblastine_1004等。
圖5免疫微環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)的分析
6.膀胱癌中生物標(biāo)志物的單細(xì)胞分析
通過(guò)scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，對(duì)核心細(xì)胞進(jìn)行篩選，鑒定出2000個(gè)表達(dá)水平差異較大的基因，以便進(jìn)行后續(xù)分析。PCA結(jié)果顯示，樣本細(xì)胞的總體分布相似，沒有離群值樣本，共篩選了15個(gè)主成分（p<0.05）用于后續(xù)分析。另外，所有核心細(xì)胞的P值均小于0.05，因此我們使用所有核心細(xì)胞進(jìn)行分析。聚類結(jié)果表明，核心細(xì)胞被分離成10個(gè)主要的不同的聚類。并對(duì)差異標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定，并繪制每個(gè)聚類中前10個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)熱圖。這些集群包括兩種帶有上皮細(xì)胞和DC細(xì)胞的細(xì)胞。由于采集的樣本為上皮細(xì)胞，DC細(xì)胞所占比例相對(duì)較小，因此取出DC細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。將核心細(xì)胞投射到一個(gè)根和兩個(gè)分支上，構(gòu)建單個(gè)細(xì)胞軌跡圖。所有生物瘤的表達(dá)情況均發(fā)生了變化。將單細(xì)胞GSE135337數(shù)據(jù)集中的GSM4006644樣本的核心細(xì)胞根據(jù)其基因表達(dá)譜分為兩個(gè)聚類。這些聚類被命名為低表達(dá)組（聚類1）和高表達(dá)組（聚類2）。然后，統(tǒng)計(jì)兩組之間的細(xì)胞類型。聚類2和聚類3在兩組中差異最大。此外，簇2和簇3的細(xì)胞分別受到其他簇細(xì)胞的影響。（圖6）
圖6 單細(xì)胞RNA測(cè)序分析
7.驗(yàn)證基因表達(dá)水平
本研究采用qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了10例患者的生物標(biāo)志物（ABCC4、FASN、FASN、ATP2B4、ATP8B2、MTHFD1L）在正常對(duì)照組和癌組織中的表達(dá)水平。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，這些基因的表達(dá)水平存在顯著性差異。癌組織中FASN和MTHFD1L的mRNA水平顯著升高，而ABCC4、ATP2B4和ATP8B2的mRNA水平顯著降低。（圖7）
圖7 qRT-PCR分析ABCC4、FASN、ATP2B4、ATP8B2和MTHFD1L的mRNA水平
綜上所述，本研究構(gòu)建了一種基于與代謝重編程相關(guān)的臨床和分子因素的新預(yù)后模型，有可能改善膀胱癌患者獨(dú)立預(yù)后的預(yù)測(cè)和管理，從而獲得更好的治療結(jié)果和生存率。本研究的主要優(yōu)勢(shì)在于利用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)聯(lián)合分析鑒定體細(xì)胞突變驅(qū)動(dòng)的代謝相關(guān)基因在膀胱癌中的生物學(xué)意義。
本項(xiàng)研究第一作者是山西醫(yī)科大學(xué)博士魏亮，而山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院楊曉峰作為該論文的通訊作者。本研究工作獲得山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目面上項(xiàng)目“卡介苗無(wú)反應(yīng)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌單細(xì)胞免疫組庫(kù)信息學(xué)特征的研究（編號(hào)：20210302124412）”的經(jīng)費(fèi)支持。
