山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院楊曉峰課題組構(gòu)建膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床預(yù)測模型及篩選其新的相關(guān)生物標(biāo)志物
膀胱癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，雖然近年來膀胱癌的診斷和治療方法不斷創(chuàng)新和發(fā)展，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍然不可避免，這也是導(dǎo)致膀胱癌患者死亡的主要原因。肌層浸潤性膀胱癌是膀胱癌的一種侵襲性較高的病理分型，盡管根治性膀胱切除術(shù)和淋巴結(jié)清掃術(shù)是最佳的手術(shù)治療方案，同時基于病理使用輔助化療或免疫治療是較好的治療方案，但其轉(zhuǎn)移率和死亡率仍較高，更早期及更準(zhǔn)確地識別疾病是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，將有助于臨床決策和改善患者預(yù)后。因此，識別不良預(yù)后的高?；颊呋蛟缙陬A(yù)測膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)生關(guān)注膀胱癌的主要問題。
本研究通過篩選膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床和病理相關(guān)危險因素，構(gòu)建其臨床預(yù)測模型，并驗(yàn)證其可行性。回顧性分析232例根治性全膀胱切除術(shù)患者，分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，每個集分為膀胱癌淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組和膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，篩選相關(guān)危險因素納入多因素logistic回歸分析，采用ROC曲線下面積、校準(zhǔn)曲線以及臨床決策曲線分析等，對構(gòu)建的預(yù)測模型的有效性進(jìn)行評價及外部驗(yàn)證，并建立列線圖（圖1）。
圖1 膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床預(yù)測模型列線圖
通過生物信息學(xué)方法，分析膀胱癌淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組和膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間差異基因的表達(dá)情況（圖2），兩組之間有741個差異表達(dá)mRNA（403個下調(diào)和338個上調(diào)），364個差異表達(dá)lncRNA（217個下調(diào)和147個上調(diào)）和28個差異表達(dá)miRNA（24個下調(diào)，4個上調(diào)）。對差異表達(dá)基因mRNA進(jìn)行了GO及KEGG富集分析。構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，包括2個mRNA（GRIA2和ETNPPL），21個lncRNA(LINC00303、RMRP、MUC19、EFCAB6-AS1、LINC00393、PRICKLE2-AS3、GRM7-AS3、ST7-AS2、SMCR5、FAM155A-IT1、HCG22、LINC00452、LINC00112、ERVH48-1、LINC00330、AC009803.1、SOX2-OT、LINC00536、FAM181A-AS1、LINC00520、LINC00261)，和5個miRNA（hsa-mir-508、hsa-mir-206、hsa-mir-215、hsa-mir-124、hsa-mir-506）。其中ceRNA關(guān)系配對如下，lncRNA（HCG22、SOX2-OT、LINC00520、LINC00261）-miRNA（hsa-mir-124）-mRNA（GRIA2，ETNPPL）。
圖2 膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（-）和膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）之間差異表達(dá)的基因（A.DEGs mRNA熱圖，B.DEGs lncRNA熱圖，C.DEGs miRNA熱圖，D.DEGs mRNA火山圖，E.DEGs lncRNA火山圖，F(xiàn).DEGs miRNA火山圖）
計(jì)算兩組膀胱癌樣本中免疫細(xì)胞類型及相對比例情況，篩選差異顯著的免疫細(xì)胞類型（圖3）；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示BcLNM-和BcLNM+之間的幼稚B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+記憶激活T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖3 膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（-）和膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）兩組免疫細(xì)胞比例分析（A.兩組樣品中22個免疫細(xì)胞的豐度比，B.兩組樣品中22個免疫細(xì)胞的熱圖，C.小提琴圖）
構(gòu)建無尺度加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定與臨床性狀相關(guān)的共表達(dá)基因和模塊。根據(jù)相關(guān)系數(shù)和平均連接度最終確定軟閾值為4，驗(yàn)證構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)符合無尺度網(wǎng)絡(luò)（圖4）。通過動態(tài)混合剪切法，最終得到基因模塊共13個，對臨床樣本進(jìn)行聚類，繪制樣本聚類圖和樣本臨床資料熱圖。通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊與臨床表型關(guān)聯(lián)分析，模塊中研究與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期有關(guān)模塊，MEyellow（黃色）模塊相關(guān)性最大，將其中的模塊成員值（MM值）和N分期的基因顯著性值（GS值）做相關(guān)性分析，篩選與N分期高度相關(guān)基因也是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵基因，最后得到該模塊與N分期相關(guān)的前20個關(guān)鍵基因（表1）。
圖4 拓?fù)渚仃噲D和模塊相關(guān)熱圖（A.拓?fù)渚仃噲D，通過計(jì)算基因表達(dá)譜的相關(guān)矩陣和鄰接矩陣，將其轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣圖，各個模塊的交互關(guān)系，由于對角線表示模塊內(nèi)部基因之間的相互作用，所以對角線上的顏色最深；B.WGCNA中模塊鄰接度的相關(guān)熱圖）
表1 N分期表型相關(guān)的Top20 hub基因名稱
模塊顏色 |
hub基因 |
英文 |
中文 |
black |
KRT6A |
Keratin 6A |
角蛋白6A |
blue |
PJA2 |
Praja Ring Finger Ubiquitin Ligase 2 |
環(huán)指泛素連接酶2 |
brown |
KPNA2 |
Karyopherin Subunit Alpha 2 |
核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞單位α 2 |
green |
CCNL2 |
Cyclin L2 |
細(xì)胞周期蛋白L2 |
greenyellow |
ZFP36 |
ZFP36 Ring Finger Protein |
ZFP36環(huán)指蛋白 |
magenta |
ITGB2 |
Integrin Subunit Beta 2 |
整合素亞單位β 2 |
pink |
TAP2 |
Transporter 2 |
轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 |
red |
SPARC |
Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich |
富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白 |
salmon |
PPL |
Periplakin |
旁血小板溶蛋白 |
tan |
PSMB7 |
Proteasome 20S Subunit Beta 7 |
蛋白酶體20S亞單位β 7 |
turquoise |
AURKAIP1 |
Aurora Kinase A Interacting Protein 1 |
極光激酶A相互作用蛋白1 |
yellow |
RPS14 |
Ribosomal Protein S14 |
核糖體蛋白質(zhì)S14 |
本研究聚焦膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為研究方向，從其臨床危險因素建立膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測模型并進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證；同時，本研究比較膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和膀胱癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩組的生物信息學(xué)差異，構(gòu)建膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的競爭性內(nèi)源性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、腫瘤微環(huán)境中免疫浸潤模式以及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及相關(guān)的生物標(biāo)志物，為膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床診斷及治療和基礎(chǔ)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
